Ekspresi Gen Pada Bakteri Rekombinan

Ekspresi Gen

Protein dan enzim sangat berperan dalam menjalankan metabolisme maka ekspresi gen sebenarnya merupakan proses pengendalian metabolisme oleh gen. ekspresi gen atau sintesis protein dapat diatur, dihidupkan atau dimatikan, sebagaimana layaknya aliran listrik. Proses pengaturan ini dilakukan dengan cara menghentikan produk enzim, melalui penghentian ekspresi gen penyandinya. Mekanisme pengaturan ekspresi gen disebut regulasi ekspresi gen.

Regulasi ekspresi gen banyak dimengerti melalui mekanisme yang dipelajari pada bakteri. Sistem regulasi yang pertama dimengerti ialah sistem regulasi operon laktosa pada bakteri E. coli oleh Jacob dan Monod. Regulasi ini berperan dalam mengatur produksi enzim ß-galaktosidase, ketika bakteri harus memilih menggunakan laktosa atau glukosa  sebagai sumber karbonnya.

Ada dua sistem pengaktifan ekspresi gen

1.     Ekspresi Gen secara Konstitutif  adalah Gen ini bisa diekspresikan dalam keadaan apapun.

2. Ekspresi Gen secara induktif adalah Gen ini bisa diekspresikan dalam keadaan yang  memungkinkan / ada proses induksi.

Sistem Pengendalian Ekspresi ada 2 macam :

1.    Sistem Pengendali Ekspresi Negatif

Pengendalian Negatif artinya Pengendali negatif gen di nonaktifkan oleh produk ekspresi gen regulator. Reseptor juga sebagai pengendali negatif.

2.    Sistem Pengendali Ekspresi Positif

Pengendalian Positif artinya pengendalian ini melibatkan aktivitas ( aktifator ) sesuatu gen regulator dan gen ini dapat diaktifkan oleh produk ekspresi gen regulator.

Bakteri Rekmbinan

Organisme transgenik organisme yang membawa gen yang berasal dari jenis organisme lainnya. Organisme transgenik dihasilkan melalui Rekayasa Genetika. Rekayasa Genetika menggunakan Teknologi DNA Rekombinan. Teknologi DNA Rekombinan kumpulan teknik atau metoda yang digunakan untuk mengkombinasikan gen-gen secara buatan.

Teknologi DNA Rekombinan meliputi:

- Teknik untuk mengisolasi DNA

- Teknik untuk memotong DNA.

- Teknik untuk menggabung atau menyambung DNA

- Teknik untuk memasukkan DNA ke dalam sel hidup sehingga DNA rekombinan dapat bereplikasi      dan dapat diekspresikan.

Teknologi DNA Rekombinan berdasarkan mekanisme yang ada pada bakteri. Percobaan Lederberg dan Tatum (1946) menunjukkan bakteri mempunyai mekanisme seksual :

- Menyebabkan terbentuknya kombinasi gen-gen yang berasal dari dua sel yang berbeda.

- Merupakan pertukaran DNA atau gen dari satu sel ke sel lainnya. Mekanisme seksual pada bakteri      ini tidak bersifat reproduktif (tidak menghasilkan anak atau zuriat) 

DNA Masuk Ke dalam Sel Bakteri

DNA dapat masuk ke dalam sel bakteri melalui 3 cara :

1.    Konjugasi

Konjugasi merupakan perpindahan DNA dari satu sel (sel donor) ke dalam sel bakteri lainnya (sel resepien) melalui kontak fisik antara kedua sel. Sel donor memasukkan sebagian DNA-nya ke dalam sel resepien. Transfer DNA ini melalui pili seks yang dimiliki oleh sel donor. Sel resepien tidak memiliki pili seks. DNA dari sel resepien berpindah ke sel resipien secara replikatif sehingga setelah proses ini selesai, sel jantan tidak kehilangan DNA. Ke dua sel tidak mengalami peningkatan jumlah sel dan tidak dihasilkan sel anak. Oleh karena itu, proses konjugasi disebut juga sebagai proses atau mekanisme seksual yang tidak reproduktif.

2.    Transformasi

Transformasi merupakan pengambilan DNA oleh bakteri dari lingkungan di sekelilingnya. DNA yang berada di sekitar bakteri (DNA asing) dapat berupa potongan DNA atau fragmen DNA yang berasal dari sel bakteri yang lain atau organisme yang lain. Masuknya DNA dari lingkungan ke dalam sel bakteri ini dapat terjadi secara alami. Tahun 1944 ditemukan bahwa perubahan sifat atau transformasi dari bakteri yang tidak virulen menjadi virulen disebabkan oleh adanya DNA dari sel bakteri strain virulen yang masuk ke dalam bakteri strain yang tidak virulen.

3.    Transduksi

Transduksi adalah cara pemindahan DNA dari satu sel ke dalam sel lainnya melalui perantaraan bakteriofage. Beberapa jenis virus berkembang biak di dalam sel bakteri. Virus-virus yang inangnya adalah bakteri sering disebut bakteriofage. Ketika virus menginfeksi bakteri, fage memasukkan DNA-nya ke dalam sel bakteri. DNA tersebut kemudian akan bereplikasi di dalam sel bakteri atau berintegrasi dengan kromosom bakteri. DNA fage yang dikemas ketika membentuk partikel fage baru akan membawa sebagian DNA bakteri yang menjadi inangnya. Selanjutnya jika fage tersebut menginfeksi bakteri yang lain, maka fage akan memasukkan DNA-nya yang sebagian mengandung DNA sel inang sebelumnya. Jadi, secara alami fage memindahkan DNA dari satu sel bakteri ke bakteri yang lain.

DNA yang masuk ke dalam sel bakteri dapat berintegrasi dengan DNA atau kromosom bakteri sehingga terbentuk DNA rekombinan atau kromosom rekombinan. Setelah DNA rekombinan terbentuk, maka dilakukan proses transformasi ke host cell kemudian dilakukan proses inkubasi sel bakteri tersebut. Setelah dilakukan inkubasi maka sel bakteri dapat diuji kehadiran DNA rekombinannya yaitu melalui uji antibiotik, uji medium seleksi dan seleksi putih biru. Setelah didapatkan bakteri dengan DNA rekombinan maka dilakukan purifikasi untuk mengisolasi gen yang direplikasi.

Perangkat yang digunakan dalam teknik DNA rekombinan diantaranya enzim restriksi untuk memotong DNA, enzim ligase untuk menyambung DNA dan vektor untuk menyambung dan mengklonkan gen di dalam sel hidup, transposon sebagai alat untuk melakukan mutagenesis dan untuk menyisipkan penanda, pustaka genom untuk menyimpan gen atau fragmen DNA yang telah diklonkan, enzim transkripsi balik untuk membuat DNA berdasarkan RNA, pelacak DNA atau RNA untuk mendeteksi gen atau fragmen DNA yang diinginkan atau untuk mendeteksi klon yang benar. Vektor yang sering digunakan diantarnya plasmid, kosmid dan Bakteriofage.

Teknologi DNA rekombinan mempunyai dua segi manfaat. Pertama, dengan mengisolasi dan mempelajari masing-masing gen akan diperoleh pengetahuan tentang fungsi dan mekanisme kontrolnya. Kedua, teknologi ini memungkinkan diperolehnya produk gen tertentu dalam waktu lebih cepat dan jumlah lebih besar daripada produksi secara konvensional.

Perangkat Utama yang Digunakan pada Pembentukan DNA Rekombinan

1.    Plasmid

Terdapat pada bakteri, DNA selain kromosom, Berbentuk sirkuler, Umumnya berukuran kecil (lebih kecil dari ukuran kromosom bakteri), Jenis, jumlah dan ukurannya bervariasi antar sel dan antar jenis bakteri.

2.    Enzim Restriksi

Contoh: EnzimEcoRI telah diisolasi pertama kali oleh Herbert Boyer pada tahun 1969 dariE.coli. EnzimEcoRI memotong pada bagian antara basa G dan A pada sekuens GAATTC

Setiap enzim restriksi (endonuklease restriksi) mengenal sekuen pemotongan yang khas dan memotong DNA pada situs pemotongan yang khas.

Nama Enzim	Sekuens Pengenal	Organisme Asal
EcoRI	G↓AATTC	Escherichia coli
HindIII	A↓AGCTT	Haemophilus influenzae
HhaI	GCG↓C	Haemophilus haemolyticus
TaqI	T↓CGA	Thermus aquaticus
BsuRI	GG↓CC	Bacillus subtilis
BalI	TGG↓CCA	Brevibacterium albidum
NotI GC↓GGCCGC	GC↓GGCCGC	Nocardia otidiscaviarum
BamHI	G↓GATCC	Bacillus amyloliquefaciens
SmaI	CCC↓GGG	Serratia marcescens

3.    DNA Ligase

DNA ligase untuk menyambung DNA

4.    Bakteri

Bakteri Escherichia coli atau biasa disingkat E. coli adalah salah satu jenis spesies utama bakteri gram negatif yang berbentuk basil atau batang. Ukuran panjang sel E.coli rata-rata sekitar 2 mikrometer, dengan volume sel sekitar 0,7 mikrometer kubik. E.coli hidup pada suhu di antara 20 hingga 45 ^oC. Pada umumnya, bakteri yang ditemukan oleh Theodor Escherich ini dapat ditemukan dalam usus besar manusia, berfungsi membusukkan sisa-sisa makanan yang melewati saluran usus besar dengan memadatkannya hingga dikeluarkan dalam bentuk feses.

Kebanyakan E. Coli tidak berbahaya, tetapi beberapa seperti E. Coli tipe O157, H7, dapat mengakibatkan keracunan makanan yang serius pada manusia yaitudiare berdarah karena eksotosin yang dihasilkan bernama verotoksin. Toksin ini bekerja dengan cara menghilangkan satu basa adenin dari unit 28S rRNA, sehingga menghentikan sintesis protein.  Sumber bakteri ini contohnya adalah daging yang belum masak, seperti daging hamburger yang belum matang.

E. Coli yang tidak berbahaya dapat menguntungkan manusia dengan memproduksi vitamin K, atau dengan mencegah bakteri lain di dalam usus. E. coli banyak digunakan dalam teknologi rekayasa genetika. Yaitu digunakan sebagai vektor untuk menyisipkan gen-gen tertentu yang diinginkan untuk dikembangkan.  Pertumbuhannya yang sangat cepat dan penanganan yang sangat mudah , membuat E. coli menjadi bakteri pilihan untuk proses rekayasa genetika. Keberadaan rekayasa genetika di seluruh dunia tidak pernah terlepas dari E.coli, karena struktur DNA-nya yang sangat sederhana dan mudah dimodifikasi. E.coli juga sering digunakan sebagai media untuk cloning atau rekombinasi DNA. Tidak sedikit pula industri bahan kimia yang mengaplikasikan teknologi fermentasi dengan menggunakanE.coli pada produksi obat-obatan, misalnya seperti insulin dan antibiotik.

soerakarta, 1 januari 2015

ahmad walid