Plasmid
adalah DNA ekstrakromosomal yang dapat bereplikasi secara autonom dan bisa
ditemukan pada sel hidup. Di dalam satu sel, dapat ditemukan lebih dari satu
plasmid dengan ukuran yang sangat bervariasi namun semua plasmid tidak
mengkodekan fungsi yang penting untuk pertumbuhan sel tersebut. Umumnya,
plasmid mengkodekan gen-gen yang diperlukan agar dapat bertahan pada keadaan
yang kurang menguntungkan sehingga bila lingkungan kembali normal, DNA plasmid
dapat dibuang.
Sebagian
besar plasmid memiliki struktur sirkuler, namun ada juga plasmid linear yang
dapat ditemukan pada mikroorganisme tertentu, seperti Borrelia burgdorferi dan Streptomyces.
Plasmid ditemukan dalam bentuk DNA utas ganda yang sebagian besar tersusun
menjadi superkoil atau kumparan terpilin. Struktur superkoil terjadi karena
enzim topoisomerase membuat sebagian DNA utas ganda lepas (tidak terikat)
selama replikasi plasmid berlangsung. Struktur superkoil akan menyebabkan DNA
plasmid berada dalam konformasi yang disebut lingkaran tertutup kovalen atau covalently closed circular (ccc), namun
apabila kedua utas DNA terlepas maka akan plasmid akan kembali dalam keadaan
normal (tidak terpilin) dan konformasi tersebut disebut sebagai open circuler
(oc)
Plasmid memiliki
sifat-sifat antara lain sebagai berikut.
- Merupakan molekul DNA yang mengandung gen tertentu; ukurannya kira-kira 1/1.000 kali kromosom (DNA) bakteri.
- Dapat memperbanyak diri melalui proses replikasi. Dengan demikian terjadi aan DNA yang menghasilkan plasmid dalam jumláh banyak. Satu sel dapat berisi banyak plasmid.
- Plasmid dapat dipindahkan ke sel bakteri lain. Perpindahan plasmid dapat dipercepat dengan memberi ion CsC1 (sesium kiorida). Dengan demikian, plasmid dapat dikeluarkan atau dimasukkan ke dalam sel bakteri atau ragi.
- Sifat plasmid pada keturunan bakteri sama dengan induknya, karena plasmid tidak terikat dengan kromosom inti.
Plasmid biasanya digunakan sebagai vektor
untuk kloning. Plasmid juga dapat dipindahkan antar sel bakteri dengan cara
konjugasi atau transformasi. Plasmid mulai digunakan sebagai vektor untuk
mengklon gen tidak lama setelah David Jackson, Robert Simon dan Paul Berg
berhasil membuat molekul DNA rekombinan itu pada tahun 1972. Dalam hal ini,
plasmid digunakan sebagai pembawa fragmen DNA asing. Dengan kata lain, plasmid
dikombinasikan dengan DNA asing. Plasmid rekombinan yang pertama kali berhasil
bereplikasi di dalam sel bakteri adalah plasmid pSC101 yang telah dikonstruksi
oleh Stanley Cohen dan Herbert Boyer (SC=Stanley Cohen).
Penamaan plasmid
biasanya diawali dengan “p” diikuti oleh serangkaian kode yang menunjukkan
identitas plasmid tersebut. Contoh plasmid yang umum digunakan sebagai vektor
adalah pUC118, pUC119, pBR322. Plasmid-plasmid ini masing-masing membawa gen
penanda resistensi terhadap antibiotik yang dapat digunakan sebagai dasar dalam
seleksi koloni yang membawa plasmid dan yang tidak. Beberapa plasmid memiliki
MCS (Multiple Cloning Site) pada gen
lacZ yang menyandikan enzim β-galactosidase, sehingga memungkinkan melakukan
seleksi biru putih. Jika vektor tersebut telah membawa gen tertentu, di
belakang nama plasmid juga disertakan keterangan mengenai gen yang dibawanya
(contoh: pAP01 (amyH), berarti plasmid hasil konstruksi ini mengandung gen
amyH).
Metode lisis alkali atau sentrifugasi
dalam gradien CsCl adalah suatu
yang digunakan untuk mengisolasi DNA plasmid dari
keseluruhan genom yang dimiliki oleh bakteri. Kedua metode ini akan memisahkan DNA
plasmid dari DNA kromosom berdasarkan kerapatannya. Pada metode lisis alkali,
sel bakteri dilisis dalam suasana alkali sehingga dsDNA akan terdenaturasi
menjadi ssDNA. Setelah dinetralkan, DNA plasmid yang berukuran lebih kecil
dibandingkan DNA kromosom akan lebih cepat mengalami renaturasi. Selanjutnya
dengan sentrifugasi keduanya dapat dipisahkan. Metode ini dapat menghasilkan
plasmid dengan kemurnian yang tinggi.
Metode untuk mendapatkan plasmid kemurnian yang tinggi, sekarang ini
telah banyak dikembangkan suatu kit untuk isolasi plasmid. Dibandingkan dengan
metode lisis alkali konvensional, dengan menggunakan kit, pekerjaan menjadi lebih
cepat dan mudah. biasanya cara
semacam ini menggunakan agen pengikat DNA dalam bentuk beads atau spin column
yang akan mengikat DNA dengan kuat sehingga pengotor lainnya dapat dihilangkan
saat pencucian. Setelah itu, DNA dapat diperoleh kembali dengan menambahkan
suatu larutan yang dapat melepaskan ikatan antara DNA dengan agen tersebut
(proses elusi).
PLASMID REKOMBINAN
Teknik
Rekayasa genetika adalah teknik memodifikasi gen-gen spesifik untuk tujuan
tertentu dan memindahkannya diantara organisme yang berbeda. Rekayasa genetika
ditujukan untuk membuat produk yang bermanfaat. Dengan menggunakan teknologi
DNA, para ahli menyisipkan gen dengan sifat yang diinginkan ke dalam molekul
DNA sehingga dihasilkan DNA rekombinan.
Bakteri
paling umum digunakan untuk memperbanyak gen, karena di dalam sel bakteri
terdapat suatu “DNA sirkuler”
yang dikenal dengan plasmid. Plasmid mudah diisolasi dari sel bakteri. Plasmid
dapat disisipi oleh gen dengan sifat tertentu sehingga menjadi plasmid rekombinan. Plasmid rekombinan dimasukkan kembali
ke dalam sel bakteri, sehingga memperbanyak gen yang kita kehendaki.
Plasmid
pBR322 dan pUC8 merupakan contoh plasmid yang digunakan sebagai vektor kloning.
Agar dapat digunakan sebagai vektor kloning, plasmid harus memenuhi
syarat-syarat berikut ini:
- Mempunyai ukuran
relatif kecil bila dibandingkan dengan pori dinding sel inang sehingga
dapat dengan mudah melintasinya,
- Mempunyai
sekurang-kurangnya dua gen marker yang dapat menandai masuk tidaknya
plasmid ke dalam sel inang,
- Mempunyai tempat
pengenalan restriksi sekurang-kurangnya di dalam salah satu marker yang
dapat digunakan sebagai tempat penyisipan fragmen DNA, dan
- Mempunyai titik
awal replikasi (ori) sehingga dapat melakukan replikasi di dalam sel
inang.
Plasmid
pBR322 mengandung gen penyandi resistensi terhadap ampisilin dan tetrasiklin.
Adanya gen resistensi terhadap antibiotik yang di dalamnya mengandung situs
enzim restriksi yang akan memudahan dalam menyeleksi plasmid rekombinan, dengan
adanya enzim yang hanya memotong bagian gen yang resisten terhadap antibiotik.
Misalnya, enzim BamHI yang akan memotong plasmid pBR322 pada bagian gen yang
resistensi terhadap tetrasiklin (gen TetR). Proses pemotongan plasmid bukanlah
sesuatu yang mudah.
Ada
dua kemungkinan setelah pemotongan, yaitu:
a.
Plasmid pBR322 yang
tersambung kembali membentuk lingkaran seperti semula, dan
b.
Plasmid rekombinan
yaitu plasmid pBR322 yang telah disisipi dengan DNA asing.
Plasmid
pBR322 yang telah kehilangan bagian yang resistensi terhadap tetrasiklin
kemudian disisipi dengan fragmen dari DNA asing. Plasmid pBR322 ini kemudian
dimasukkan ke dalam sel inangnya yaitu E.
coli. Pengujian lebih lanjut apakah plasmid ini telah tersisipi oleh
fragmen DNA asing atau tidak adalah dengan menbedahkannya pada medium
ampisilin, untuk kemudian memplatingnya ke dalam medium tetrasiklin dan
ampisilin. Koloni E. coli yang telah
kehilangan marker tetrasiklin akan sensitif tetrasiklin, sedangkan pada medium
ampisilin, koloni ini tetap tumbuh karena masih resistensi ampisilin.
Plasmid pUC118 dan pUC119 adalah plasmid lain yang telah lama digunakan sebagai vektor
untuk mengklon gen. Plasmid
tersebut merupakan pengembangan dari pBR322. Plasmid pUC118
dan pUC119 mengandung gen lacZ yang menyandikan enzim β-galaktosidase. Pada
lacZ terdapat daerah yang disebut daerah polikloning. Pada daerah ini terdapat
banyak situs restriksi dari berbagai enzim restriksi. Dalam hal ini, kita dapat
menggunakan berbagai enzim restriksi untuk memotong pUC118 dan pUC119 pada
bagian lacZ. Bila gen lacZ disisipi oleh DNA asing maka gen lacZ tersebut tidak
berfungsi (tidak menghasilkan β-galaktosidase). Bila kita menggunakan pUC118
atau pUC119 sebagai vektor, maka koloni yang membawa plasmid rekombinan dapat
dideteksi dengan menggunakan Xgal (5-bromo-4-chloro-indolyl-β-D-galactosida).
Enzim β-galaktosidase akan memecah Xgal menjadi galaktosa dan
5-bromo-4-chloroindigo yang berwarna biru. Koloni bakteri akan berwarna putih
bila pUC118 atau pUC119 telah disisipi DNA asing pada bagian lacZ. Dalam hal
ini sel bakteri tidak menghasilkan enzim β-galaktosidase karena gen lacZ. Gen
lacZ tidak berfungsi karena disisipi oleh DNA asing.
Dari beberapa perangkat seperti enzim restriksi, enzim
DNA ligase dan plasmid telah
memungkinkan bagi kita untuk mengklonkan gen atau fragmen DNA. Kita dapat membuat plasmid rekombinan di dalam tabung reaksi. Bila
dikombinasikan dengan salah satu cara bakteri memindahkan DNA yaitu
transformasi, kita dapat memasukkan plasmid rekombinan tersebut ke dalam sel
bakteri.
TRANSFORMASI
PLASMID REKOMBINAN
Transformasi plasmid rekombinan merupakan
salah satu metode untuk memasukkan plasmid rekombinan ke dalam sel
bakteri atau penyisipan materi genetik eksternal yang
berupa fragmen DNA, baik DNA kromosom maupun DNA plasmid ke dalam sel. Transformasi bakteri mula-mula diperkenalkan oleh Frederick
Griffith pada tahun 1982, berdasarkan kenyataan bahwa suatu bakteri dapat
melepaskan fragmen DNA-nya ke dalam suatu medium yang kemudian akan masuk ke
dalam sel bakteri yang lain dalam kultur tersebut. Di alam, fragmen DNA
tersebut biasanya dilepaskan oleh sel bakteri yang mati atau mengalami
autolisis. Namun, terdapat sel lain yang ternyata memang melepaskan fragmen DNA
pada saat pertumbuhan karena adanya gen tra. Metode ini sekarang
secara luas dipakai untuk mentransfer plasmid kecil dari satu
galur bakteri ke galur lainnya (Hanahan
1983). Prinsip dari transformasi adalah dengan ekstraksi DNA
dari sel donor, kemudian dicampur dengan sel resipien yang telah
dibuat rentan terhadap masuknya molekul DNA melalui pori atau saluran
dalam dinding dan membran sel (Cowell & Austin 1997).
Pada dasarnya dinding sel berfungsi
melindungi sel dari masuknya benda-benda asing termasuk DNA, tapi dalam kondisi
tertentu, dinding sel ini bisa memiliki semacam celah yang bisa dimasuki DNA.
Sebetulnya ada lebih dari 1% spesies bakteri mampu melakukan transformasi
secara alami. Dimana mereka memproduksi protein-protein tertentu yang dapat
membawa DNA menyeberangi dinding sel. Sedangkan di laboratorium, kita dapat
membuat suatu bakteri menjadi kompeten (istilah untuk bakteri yang siap
bertransformasi), misalnya dengan mendinginkannya pada larutan yang mengandung
kation divalen seperti Ca2+ untuk membuat dinding sel menjadi permeable dan
dapat dilalui oleh DNA plasmid. Dengan melakukan teknik ‘heat-shock‘
—
mendinginkan, memanaskan dan mendinginkan kembali–
bakteri, maka DNA dapat masuk ke dalam sel. Teknik ini ditemukan oleh trio
peneliti Stanley Cohen, Annie Chang, Leslie Hsu pada tahun 1972.
Metode
yang digunakan dalam transformasi plasmid DNA, antara lain;
1. Metode
Elektroporasi
Elektroporasi merupakan metode yang
menggunakan kejutan listrik untuk memperbesar pori-pori membran sel sehingga
dapat meningkatkan permeabilitas membran. Untuk melakukan metode ini, sel harus
terlebih dahulu ditumbuhkan pada media hingga mencapai masa di sekitar
pertengahan fase log. Lalu sinyal elektrik akan menginduksi perbesaran
pori-pori membran sehingga molekul yang berukuran kecil seperti DNA dapat
masuk. Efisiensi dari metode ini berbanding terbalik dengan peningkatan ukuran
plasmid. Jadi metode transformasi adalah metode yang paling efisien. Metode ini
juga dapat digunakan untuk mentransformasikan DNA ke dalam bakteri gram negatif
dan positif lainnya (tidak hanya E. coli).
Untuk transformasi metode elektroporasi,
biasanya sebagai berikut:
a. Set
micropulser 2,5 kV, 25 mF, 200-400 ohms. Untuk sel mamalia dan sel protoplast
membutuhkan 0,5-8 kV/cm, sedangkan untuk E. coli sekitar 12,5 kV/cm.
b. Masukkan
5 pg – 500 mg DNA (dalam 1-2 mL) ke eppendorf tube yang berisi sel kompeten
yang sudah disiapkan sebelumnya, baik dengan metode ini maupun metode ini.
Campur dengan cara memipet secara lembut, jangan sampai ada gelembung udara.
c. Pindahkan
DNA dan sel kompeten di atas ke dalam cuvette yang sudah didinginkan di bak es
selama 5 menit, ketuk-ketuk perlahan agar campuran tersebut sampai ke dasar
cuvette, lalu keringkan dinding luar cuvette dengan Kimwipe (sampai kering
betul). JIka tidak ada Kimwipe boleh menggunakan tissue yang benar-benar halus.
d. Letakkan
cuvette ke dalam sumurnya.
e. Tekan
tombol pulse 5-10 detik (pada beberapa alat sampai terdengar bunyi “beep”).
f. Ambil
cuvette dan segera masukkan 1 mL medium SOC dengan menggunakan pipet Pasteur,
lalu segera pindahkan semuanya ke dalam 15 ml-PP tube. Inkubasi selama 30-60
menit (jangan sampai lebih dari 90 menit) di incubator shaker (250 rpm) 37
derajat Celcius.
g. Sebarkan
ke petri agar LB yang mengandung antibiotik yang sesuai.
2. Metode
CaCl2
Transformasi sel kompeten E. coli dengan
metode CaCl2 pertama kali diperkenalkan oleh Mandel dan Higa (1970).
Metode ini cukup efisien dan tidak membutuhkan alat khusus. Dagert dan Ehrlich
(1974) memodifikasi metode ini dengan meningkatkan lama paparan sel terhadap
CaCl2. Kushner (1978) berusaha meningkatkan efisiensinya dengan menggantikan
kalsium dengan kation lainnya. Sedangkan Hanahan (1983) menambahkan beberapa
senyawa lain untuk meningkatkan efisiensinya. Di bawah adalah urutan dasar yang
relatif tidak rumit :
- Siapkan 10 mg DNA yang akan ditransformasikan (volume DNA 0,01-0,025 mL). Masukkan ke dalam 15 mL round-bottom test tube. Letakkan di bak yang berisi es.
- Ambil sel kompeten yang sudah dipersiapkan, cairkan dengan cara dihangatkan dengan tangan, lalu ambil 0,1 mL sel kompeten dan segera masukkan ke dalam tube berisi DNA di atas. Goyang-goyang tabung agar DNA dan sel kompeten tercampur rata, lalu letakkan di bak yang berisi es selama 10 menit. Buang sisa sel kompeten yang tidak terpakai.
- Berikan kejutan panas dengan menempatkan tube berisi DNA dan sel kompeten tersebut ke dalam inkubator air 42 derajat Celcius selama 2 menit atau masukkan ke dalam inkubator 37 derajat Celcius selama 5 menit.
- Tambahkan ke dalam tube tersebut 1 mL medium LB. Inkubasi di incubator shaker (250 rpm) 37 derajat Celcius selama 1 jam.
- Sebarkan ke petri agar LB yang mengandung antibiotik yang sesuai. Inkubasi 37 derajat Celcius selama 12-16 jam.
3.
Metode Kalsium – Fosfat
Metode ini pertama kali diperkenalkan
oleh Wigler dkk (Wigler et al, 1979) dan disempurnakan oleh Chen-Okayama (Chen
and Okayama, 1987). Kelebihan dari metode ini adalah relatif murah dan
mempunyai transformasi efisiensi yang cukup tinggi, baik untuk transfeksi
transien maupun transfeksi stabil. Berikut adalah metode yang dipublikasikan
oleh Chen dan Okayama, untuk transfeksi menggunakan petri yang berdiameter 35
mm :
a. Siapkan larutan 2xBBS
(50 mM N,N-bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethane sulfonic acid (BES), 280 mM NaCl,
dan 1,5 mM Na2HPO4). Ukur pHnya dengan pH meter pada suhu kamar (250C), dan
buat serial larutan 2xBBS ber-pH 6,85 sampai 7,0 lalu sterilkan (dapat dengan
fitrasi maupun dengan menggunakan autoclave). Untuk merubah pH dapat
menggunakan larutan HCl atau NaOH. Setelah itu siapkan larutan 2,5 M CaCl2,
sterilisasi dengan filtrasi.
b. Tentukan
pH optimum larutan 2xBBS untuk transfeksi. Kita bisa gunakan plasmid yang
mengekspresikan b-galaktosidase atau lusiferase, atau protein/enzim lainnya
yang dapat diukur secara kuantitatif. Prosedur untuk melakukan transfeksi
metode Kalsium-Fosfat menurut Chen dan Okayama:
· Siapkan
sel yang akan ditransfeksi. Jika sel yang akan ditransfeksi bersifat adhesif
(melekat pada dinding petri), siapkan sel tersebut 12-18 jam sebelum
transfeksi. Jika sel yang akan ditransfeksi tidak bersifat adhesif, kita
siapkan sel tersebut saat menjelang transfeksi. Untuk petri 35 mm, kita bisa siapkan
2 x 105 – 1 x 106 sel per petri (disesuaikan dengan ukuran sel). Sebaiknya
menggunakan medium yang mengandung serum tapi tidak mengandung antibiotik.
· Siapkan
plasmid dengan konsentrasi 1 mg per 75 mL, gunakan eppendorf tube. Sebaiknya
plasmid yang akan ditransfeksikan tersebut dilarutkan dalam mEq.
· Tambahkan
ke dalam no 2 di atas 8,3 mL larutan 2,5 M CaCl2 yang sudah disterilisasi,
vortex selama 5-10 detik, biarkan dalam suhu kamar selama 5 menit.
· Tambahkan
83,3 mL larutan 2xBBS pH X, vortex selama 5-10 detik, biarkan dalam suhu kamar
selama 15 menit.
· Teteskan
seluruhnya (166,6 mL) secara hati-hati di atas sel yang sudah kita siapkan.
Goyang atau miringkan petri ke kiri dan ke kanan beberapa kali, lalu masukkan
kembali ke inkubator. Anda bisa masukkan ke inkubator 3% CO2 dulu
selama beberapa jam lalu pindahkan ke inkubator 5% CO2
(direkomendasikan) atau langsung dimasukkan ke inkubator 5% CO2.
· Setelah
beberapa jam, panen sel, dan ukur aktifitas b-galaktosidase atau lusiferasenya.
· Setelah
diketahui larutan 2xBBS yang ber-pH berapa yang paling tinggi efisiensinya,
gunakanlah larutan 2xBBS yang ber-pH tersebut untuk transfeksi selanjutnya.
Larutan 2xBBS dapat disimpan di dalam kulkas 40C.
PRINSIP TEKNOLOGI TRANSFORMASI
PLASMID REKOMBINANM
Metode mendapatkan gen
DNA memiliki ukuran yang sangat kecil
sehingga untuk mendapatkannya diperlukan metode khusus. Caranya adalah
menggunakan enzim pemotong atau enzim restriksi
Enzim pemotong dan penyambungan
Enzim pemotong atau enzim restriksi
secara umum dikenal dengan enzim restriksi endonuklease berfungsi untung memotong-motong
benang DNA yang panjang menjadi pendek agar dapat disambung-sambungkan kembali.
Enzim pemotong secara alami dimiliki oleh sel untuk memotong DNA di dalam sel. Setiap
enzim bekerja secara khusus, artinya setiap enzim hanya dapat memotong urutan
basa tertentu pada DNA. Hasil pemotongan oleh enzim retriksi adalah berupa
sepenggal DNA berujung runcing yang komplemen yang dikenal sebagai DNA ujung
runcing (stiky end).
Selain enzim restriksi endonuklease,
terdapat pula enzim Ligase yang berfungsi menyambungkan DNA. Enzim ligase DNA
mengkatalisis ikatan fosfodiester antara dua rantai DNA. Ligase DNA tidak dapat
menyambungkan DNA untai tunggal, melainkan harus DNA rangkap.
Pembawa gen atau vektor
Mengingat ukuran gen sangat kecil, maka
memasukkan gen ke dalam sel target harus menggunakan pembawa gen atau vektor.
Vektor itu bertugas sebagai “kendaraan” bagi gen untuk mengangkut gen masuk ke
dalam sel target. Kendaraan yang dikenal dengan nama vector digunakan sebagai
alat untuk memindahkan gen (sepotong molekul DNA) dari satu organisme ke
organisme hidup lain. Adapun gen yang bisa dipindahkan dapat berasal dari
molekul DNA manusia, hewan, tumbuhan dan semua organisme hidup lainnya.
Plasmid dapat digunakan sebagai “kendaraan”
bagi gen untuk mengangkut gen masuk ke dalam sel target karena secara alami
dapat keluar masuk sel. Plasmid tersebut dapat disambung dengan gen terlebih
dahulu sehingga terbentuk DNA hasil sambungan yang disebut sebagai chimera atau
DNA rekombinan. Selanjutnya, chimera dimasukkan ke dalam sel target yaitu ke
sel bakteri. Sel target akan mendapatkan sifat baru sesuai dengan gen yang
diterimanya.
Chimera berupa DNA yang akan mengadakan
replikasi di dalam sel inangnya sehingga dapat berjumlah banyak. Dengan
demikian berlangsunglah proses pengklonaan DNA. Ketika chiimera melakukan
replikasi, gen yang dibawanya akan ikut tereplikasi sehingga terjadilah
pengklonaan gen.
4 Sel
Target
Sel bakteri Escherichia coli biasa digunakan dalam rekombinasi DNA karena
beberapa alasannya, antara lain a) E.
coli mudah diperoleh dan mudah dipelihara, b) tidak mengandung gen yang
membahayakan (tidak ganas), c) dapat membelah diri setiap 20 menit sekali
sehingga dapat diperoleh keturunan dalam jumlah besar dalam waktu singkat.
CARA
GEN DITRANSFORMASI
Transformasi
bertujuan mengekspresikan suatu gen tertentu di dalam sel inang. Fragmen
DNA/insert dapat masuk ke dalam sel inang apabila dibuat DNA plasmid terlebih
dahulu dengan menyisipkannya pada suatu DNA vektor.
DNA asing akan dipotong-potong
oleh enzim yang disebut ‘Restriction Endonuclease‘/enzim restriksi.
DNA bakteri sendiri terlindungi dengan mekanisme tertentu (metilasi) sehingga
akan terhindar dari pemotongan.
Enzim restriksi (endonuklease) adalah
enzim yang berasal dari bakteri yang mampu memotong DNA double strain. Istilah
enzim restriksi berasal dari kenyataan bahwa enzim ini merupakan produk dari
satu straind bakteri yang membatasi pertumbuhan berikutnya dari bakteri lain
tertentu pada medium yang sama Dalam sel bakteri, enzim ini berfungsi sebagai
perlindungan diri dengan cara memotong DNA asing pada sisi pemotongan tertentu.
Endonuklease dapat mengenal urutan (sekuen) nukleutida pendek, antara 4-8
nukleutida, yang sering dikenal sebagai restriction site atau sisi pemotongan
atau situs pemotongan yang spesifik dan berbeda-beda.. Telah diketahui
kira-kira 200 enzim restriksi dan masing-masing enzim restriksi memotong DNA
rantai ganda pada urutan spesifik dari 4 atau 6 basa. EcoRl merupakan salah satu enzim restriksi yang memotong DNA rantai
ganda dimana urutan basa-basanya adalah guanin, adenin ,adenin, timin, timin,
dan sitosin .
5’-G A A T T C-3’
........
........
3-’C T T A A G-5’
Baik di utas atas
maupun bawah memiliki sekuen yang sama maka di sekuen palindrom itulah enzim
restriksi akan bekerja. Setiap enzim restriksi hanya dapat memotong pada
susunan palindrom tertentu. Misalnya enzim EcoRI akan bekerja jika
menemukan urutan GAATTC, enzim SmaI pada urutan CCCGGG,
enzim AluI pada urutan AGCT, dan seterusnya. Oleh karena
EcoRl memotong setiap DNA hanya pada urutan yang benar, maka DNA yang berasal
dari sumber–sumber yang jelas berbeda dapat dipotong
dan disambung bersama berdasarkan adanya ekor-ekor rantai tunggal yang
komplementer yang disebut ujung staggered. Pemotongan yang sempurna dari DNA
total dengan enzim ini akan memotong DNA tadi apabila terdapat urutan GAATTC
dan apabila setiap plasmid mempunyai DNA identik, maka DNA total akan selalu
dipotong oleh EcoRl menjadi fragmen-fragman yang sangat banyak yang tepat sama.
Pemotongan DNA tidak
dapat dilakukan secara sembarangan, masing-masing enzim memiliki titik
pemotongan tertentu. Misalnya BamHI yang mengenali situs GGATCC
akan memotong pada posisi antara dua G membentuk fragmen yang ujungnya ada yang
tidak berpasangan (sticky ends).
5'-G GATCC-3'
: :
3'-CCTAG G-5'
Sedangkan enzim PovII
yang mengenali situs CAGCTG akan memotong di tengah situs pemotongan membentuk
fragment yang semua ujungnya berpasangan (blunt ends):
5'-GGA TCC-3'
::: :::
3'-CCT AGG-5'
DNA ligase merupakan
enzim yang mengkatalisis pembentukan ikatan fosfodiester antara ujung 5’-fosfat
dan 3’-hidroksil pada DNA yang mengalami nick.
Nick pada DNA dapat terjadi pada saat replikasi DNA, rekombinasi dan kerusakan.
Secara biologis, DNA ligase diperlukan untuk menyambung potongan-potongan DNA yang baru
disintesis, serta berperan dalam proses reparasi DNA. Oleh karena pentingnya peranan DNA ligase,
sekarang ini telah dikembangkan obat antibakterial yang menginhibisi DNA
ligase. Dengan diinhibisinya DNA ligase, diharapkan kromosom menjadi terdegradasi
dan sel akan mati. DNA ligase merupakan enzim yang sangat berguna baik di dalam
sel, maupun di luar sel. Untuk penggunaan di luar sel, penggabungan dengan
enzim restriksi telah membuat terobosan baru di bidang teknologi DNA
rekombinan. Enzim restriksi diibaratkan seperti gunting yang memungkinkan kita
untuk memotong DNA di tempat yang spesifik. Kemudian DNA ligase berperan
sebagai lem yang menyambung DNA yang telah terpotong sehingga menjadi DNA yang
fungsional.
DNA ligase dapat
digolongkan menjadi 2 jenis berdasarkan kofaktor yang diperlukan, yaitu NAD+
atau ATP. DNA ligase NAD+-dependent ditemukan hanya di bakteri. Sementara itu,
DNA ligase ATP-dependent ditemukan di bakteriofage, eubacteria, archaea, dan
virus. Walaupun kedua jenis enzim ini memerlukan kofaktor yang berbeda,
keduanya memiliki mekanisme katalitik yang sama. DNA ligase ATP-dependent yang
umum adalah T4 DNA ligase dan T7 DNA ligase.
T4 DNA ligase berasal
dari T4 bakteriofage. Enzim ini akan meligasi fragmen DNA yang menggantung,
memiliki ujung kohesif maupun ujung tumpul.Untuk meligasi fragmen DNA yang
memiliki ujung tumpul, diperlukan konsentrasi enzim yang lebih besar. Proses
ligasi DNA T4 memerlukan larutan penyangga yang mengandung ATP dengan
konsentrasi 0.25-1 mM. Proses ini dapat berlangsung pada kisaran suhu yang
luas, namun untuk beberapa kasus, proses ligasi dilakukan pada suhu tertentu. Seperti
pada saat menginginkan efisiensi yang tinggi dalam ligasi (contohnya membuat
pustaka genom) suhu yang disarankan adalah 16 °C. Sementara itu, jika
ligasi bertujuan untuk subcloning, ligasi dapat dilakukan pada suhu 4 °C
semalaman, atau pada suhu ruang selama 30 menit hingga beberapa jam.
T7 DNA ligase merupakan
DNA ligase dengan ukuran terkecil, yaitu sebesar 41 kDa. DNA ligase ini berasal
dari bakteriofage T7, mempunyai struktur yang terdiri dari dua domain dengan
sisi aktif ATP yang terbentuk oleh ujung-N domain yang lebih besar.
Mekanisme DNA ligase
dimulai dari hidrolisis kofaktor, yaitu NAD+ atau ATP. Peristiwa ini menghasilkan
kompleks enzim-adenylate AMP yang berikatan kovalen dengan grup α-amino residu
lysin pada sisi aktif dengan melepaskan pyrofosfat inorganik (PPi), jika
kofaktor berupa ATP; atau nicotinamide mononucleotide (NMN), jika kofaktor
berupa NAD+. Kemudian sebagian AMP akan berpindah dari sisi aktif lysin ke
ujung bebas 5’-fosfat yang berada pada nick utas DNA.
Pada akhirnya, iktan fosfodiester akan terbentuk antara ujung 3’-OH
yang berada di ujung nick dengan 5’-fosfat dan melepaskan
AMP dan enzim adenylate.
Menyambungkan
utas-utas DNA hasil pemotongan enzim restriksi harus saling komplemen agar
dapat menempel dengan baik. Ujung overhang pada utas sense akan
berpasangan dengan ujung overhang utas antisense. Setelah
itu DNA Ligase tinggal membentuk ikatan phosphodiester sehingga kedua utas kini
sudah menjadi satu dengan ikatan yang sangat kuat. Mekanisme ini cenderung
lebih mudah karena kedua ujung overhang dapat menempel lebih dulu karena memiliki
sekuen yang saling komplemen.
Menyambungkan
utas-utas DNA yang memiliki ujung blunt hasil pemotongan enzim
restriksi DNA lebih sulit untuk ‘dilem’ dengan enzim DNA Ligase karena tidak
ada ujung overhang yang membantu
kedua utas untuk saling menempel terlebih dulu sebelum ‘dilem’.
SELEKSI BIRU-PUTIH (BLUE WHITE SELECTION)
Prinsip dari transformasi adalah
dengan ekstraksi DNA dari sel donor, kemudian dicampur
dengan sel resipien yang telah dibuat rentanterhadap masuknya
molekul DNA melalui pori atau saluran dalam dinding dan membran sel
(Cowell & Austin 1997).
Proses transformasi bakteri diawali
dengan pembuatan sel kompeten. Pencampuran sel kompeten dan DNA insert
diinkubasi bersama dengan larutan kalsium klorida (CaCl2) yang
terdapat pada TFB, fungsi larutan ini adalah megganggu keseimbangan kalsium
dalam membran sehingga membran berhasil terbuka dan DNA insert dapat masuk.
Cara kerja larutan ini adalah membantu terbukanya protein integral sebagai
kanal ion. Proses selanjutnya yaitu dikejutpanaskan (heat shock) pada suhu 42°C selama 45 detik dengan maksud membran
sel akan tertutup kembali karena terjadi perubahan suhu yang mendadak dari suhu
rendah ke suhu tinggi. Proses pengerjaan transformasi dapat dilakukan di dalam
laminar ataupun di luar laminar. Perbedaannya hanya pada kesterilan kerja dan
resiko kontaminasi pada pekerjaan di luar laminar.
Tahap selanjutnya dalam transformasi gen
adalah seleksi bakteri tertransformasi. Tahap seleksi bertujuan untuk
mengetahui mana E. coli yang
mengandung plasmid DNA rekombinan dan E.
coli yang tidak membawa rekombinan. Terdapat empat macam teknik seleksi
yang umum dilakukan, yaitu teknik replica plating, seleksi warna koloni,
komplementasi dan analisa hibridisasi. Seleksi warna salah satunya dengan tekik
blue-white selection atau seleksi
biru putih.
Seleksi biru putih atau blue-white selection adalah salah satu
metode untuk mengidentifikasi keberhasilan kloning dan transformasi. Metode ini
merupakan salah satu metode seleksi sel hasil kloning dan termasuk metode
seleksi berdasarkan warna.
Seleksi biru putih (blue-white selection) merupakan metode untuk memisahkan sel yang
mengandung plasmid rekombinan dengan sel yang mengandung plasmid tanpa insert.
Seleksi biru putih dilakukan untuk mengetahui keberhasilan proses ligasi atau
keberadaan DNA sisipan. Metode ini menggunakan media yang mengandung X-gal dan IPTG (Isopropil Thiogalaktosida) (Brown TA 1995). Transforman yang
dihasilkan ada yang berwarna biru dan putih, adanya warna biru karena senyawa X-gal dalam medium . Hasil transformasi
terlihat bahwa koloni berwarna putih terbentuk pada cawan dengan penambahan X-gal dan IPTG serta pada kontrol
positif tanpa perlakuan. X-gal adalah
molekul yang mirip galaktosa, sedangkan IPTG merupakan inducer enzim β-galaktosidase. Hasil ini sesuai dengan
literatur yang mengatakan, terbentuknya koloni berwarna putih ini berarti sel
bakteri mengandung DNA plasmid rekombinan dan proses ligasi dinyatakan berhasil
(Brown 1995). Jika proses ligasi atau penyambungan fragmen DNA tidak berhasil
ditandai dengan warna koloni berwarna biru artinya proses transformasi yang
dilakukan tidak berhasil hal ini dapat terjadi karena ukuran insert terlalu
kecil sehingga tidak mampu membuat gen lacZ terinaktifasi atau posisi
sisipan yang tidak tepat, dan insert yang diklon bersifat meracuni bagi
sel bakteri.
Transformasi dikatakan berhasil apabila
rangkaian DNA yang diintroduksikan dapat disisipkan ke genom sel inang
(bakteri), diekspresikan, dan terpelihara dalam seluruh proses pembelahan sel
berikutnya. Seleksi bakteri pembawa DNA rekombinan dapat dilakukan denan dua
cara yaitu seleksi resistensi antibiotika dan seleksi warna. Sel yang
mengandung plasmid tanpa insert ditumbuhkan pada media LA dan ampisilin
tersebut maka gen lac-Z akan terekspresikan
dan β-galaktosidase dihasilkan serta
menghasilkan koloni biru. Enzim ini akan memecah X-gal dan menghasilkan senyawa berwarna biru, begitu pula
sebaliknya, jika sel yang mengandung plasmid rekombinan ditumbuhkan atau
berhasil tersisipi maka pada media LA tersebut, maka gen lac-Z tidak akan diekspresikan dan β-galaktosidase tidak akan terbentuk. Koloni akan berwarna putih
(Brown 1995).
Salah satu cara untuk menyeleksi klon
yang benar adalah dengan menggunakan media tumbuh yang mengandung antibiotik.
Cairan suspensi dalam pekerjaan
transformasi (campuran antara bakteri, plasmid, dan DNA asing yang telah di
perlukan dalam rangka trasformasi) di sebarkan pada media yang mengandung tetasiklin. Koloni bakteri yang tumbuh
adalah koloni sel 1 dan koloni sel 2 (koloni adalah kumpulan sel yang sama yang
semula berasal dari satu sel). Sel bakteri yang tidak mengandung plasmid tidak
mampu tumbuh. Masing-masing koloni yang tumbuh pada media + tetrasklin kemudian
di pindahkan pada media + ampisilin. Koloni yang tidak tumbuh pada media +
ampisilin adalah koloni yang di inginkan (sel-sel bakterinya mengandung plasmid
rekombinasi).
Enzim β-galactosidase akan memecah Xgal
menjadi galaktosa dan 5 –bromo–4chloroindigo
(biru). Oleh karena itu koloni bakteri yang mengandung plasmid pUC118 atau
pUC119 akan berwarna biru bila di tumbuhkan pada media yang mengandung Xgal.
Pada lacZ
terdapat daerah yang di sebut daerah polikloning. Pada daerah polikloning ini
terdapat banyak situs restriksi dan berbagai enzim restriksi. Dalam hal ini, menggunakan
berbagai enzim untuk memotong pUC118 atau pUC119 pada bagian lacZ. Dengan demikian dapat menyisipkan
DNA asing pada bagian lacZ. Bila gen lacZ di sisipi oleh DNA asing maka gen
lacZ tersebut tidak berfungsi (tidak menghasilkan β-galactosidase)
Bila menggunakan pUC118 atau pUC119
sebagai plasmid vector, maka koloni yang membawa plasmid rekombinasi dapat di
deteksi dengan menggunakan media tumbuh yang mengandung Xgal (5 –
bromo – 4 – chloro –
indolyl – b – D – galactoside).
Koloni bakteri yang mengandung plasmid
pUC118 atau pUC119 akan berwarna biru karena ada gen lacZ yang menghasilkan β-galactosidase. Enzim β-galactosidase memecah Xgal menjadi galaktosa dan 5 –
bromo – 4 – cholorindigo
yang berwarna biru
Koloni bakteri akan berwarna putih bila
pUC118 atau pUC119 telah di sisipi DNA asing pada bagian lacZ. Dalam hal ini
gen lacZ tidak berfungsi karena di sisipi DNA asing. Jadi, koloni yang
mengandung plasmid rekombinan adalah koloni yang berwarna putih.
Tidak ada komentar:
Posting Komentar